10月27日，理性零星力细中国迷信院深圳先进技术钻研院于涛课题组的妄想最新钻研下场以“Metabolic reconfiguration enable synthetic reductive metabolism in yeast”为题宣告于Nature Metabolism。钻研团队经由理性妄想，构建组合磷酸戊糖循环、分解转氢循环以及外部呼吸链三个模块，双引事迷在酵母细胞内构建了一个分解能量零星，擎助其可能反对于细胞妨碍以及高复原性化合物的胞工破费，并实现40%的场往逍遥脂肪酸产率，为当初酿酒酵母钻研的信网最高水平。

该下场由中国迷信院深圳先进技术钻研院于涛试验室与查尔姆斯理工大学Jens Nielsen试验室相助配合实现，理性零星力细于涛钻研员为第一作者兼配合通讯作者，妄想深圳先进技术钻研院博士生王湘，构建钻研助理刘香健也为钻研作出紧张贡献。分解

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于涛团队自动于运用分解生物学措施，双引事迷处置可不断制作、擎助绿色能源的生物存储与食粮清静等严正下场。前期使掷中，团队乐成实现为了空气中CO2到葡萄糖与脂肪酸的制备（Nature Catalysis，2022），本使命开拓的分解的能量零星（细胞双引擎），进一步后退了脂肪酸的转化率，并为下一步开拓可再沉闷力的生物储能技术打下了根基。

细胞在生前途程中分解大份子、构建碳骨架，这些历程破费能量，且需要克制底物以及生物量之间的复原度差距。对于脂质等高价钱的储能化合物，其复原度远高于葡萄糖等底物，细胞每一每一需要格外的复原力以及能量来分解这些化合物。而这无疑需要对于细胞的代谢收集妨碍重构，由于细胞取患上能量以及复原力、分解大份子以及构建碳骨架的目的是为自己妨碍，而不是产物分解。因此，钻研者们想象，是否有可能重新构建一个分解的能量零星，其是否可能取代内源的能量零星为细胞提供能量反对于妨碍？其是否能为化学品分解提供格外的能量以及复原力？细胞内的反映高度相助，胞内的能量以及物资组成坚持在确定的比例，细胞是否能接受过多的NADPH以及NADH？

钻研团队经由理性重排复原代谢，在酵母细胞内构建了一个新型分解能量零星，运用一再的单脱羧反映以及转氢循环实现NADPH以及NADH的分解，并进一步转变为能量妨碍释放。该零星由三个模块组成：磷酸戊糖（Pentose Phosphate，PP）循环、转氢循环以及外部呼吸链（图1）。

图1：分解能量零星展现图

PP循环与转氢循环的构建

一再脱羧是细胞复原代谢的根基，因此要构建一个新的能量零星首先便是要构建一个一再脱羧循环。磷酸戊糖道路中，6-磷酸葡萄糖（G6P）被催化为5-磷酸核糖（R5P）时患上到一份子CO2，天生2份子NADPH，此为氧化阶段；之后C5份子经可逆重排，最终重构为6-磷酸果糖（F6P）以及3-磷酸甘油醛（G3P），此为非氧化阶段；G3P经部份糖异生道路可能回到G6P，再一次进入氧化阶段，这样就组成为了PP 循环。在这个循环中，1份子葡萄糖残缺氧化可能天生12份子NADPH。NADPH是细胞内的复原力通量，而NADH经由氧化呼吸链可能天生ATP。钻研者过表白酵母内源谷氨酸盐转氢酶GDH1以及GDH2，在胞质内实现1份子NADPH不可逆转变为1份子NADH的转氢循环（图2a）。

钻研者抉择了一株消除了葡萄糖效应的丙酮酸脱羧酶缺陷菌株E1B[1]（重命名为SynENG001）来测试PP循环以及转氢循环的碳通量。该菌株以氧化磷酸化为主要供能历程，可能在繁多葡萄糖碳源上妨碍，且具备较好的胞质NADH失调能耐。钻研者敲除了磷酸果糖异构酶基因pgi1，打断了糖酵解道路，后退了PP循环碳通量，患上到的菌株SynENG064不能以糖为繁多碳源妨碍；而在削减转氢循环后，患上到的菌株SynENG065在5天内可能妨碍到OD600 nm=10（图2b）。由此可预料敲除了pgi后胞内的NADPH过多，对于细胞妨碍发生抑制。在家养型酵母内敲除了pgi并过表白GDH2仅能部份复原细胞妨碍，钻研者预料这是由于转氢循环发生的过多NADH抑制细胞妨碍，因此细胞需要一个实用的呼吸链来破除了胞质内过剩的NADH。以上服从证实PP循环以及转氢循环运行精采，且两个模块有较高的碳通量。

图2：经由转氢循环破除了NADPH过多发生的毒性。a. PP循环以及不可逆的转氢循环。b. 转氢循环复原了pgi1缺失导致的妨碍缺陷。SynENG064菌株敲除了pgi1，SynENG065菌株敲除了pgi1同时过表白了GDH1以及GDH2（转氢循环）

琥珀酸是一种四碳二羧酸，从丙酮酸分解琥珀酸需要细胞提供格外的复原力NADH。钻研者在SynENG001菌株中过表白了琥珀酸分解所需要的各基因，并下调了磷酸果糖激酶（PFK）的表白水平添长碳流更多流向PP循环，使琥珀酸的产量升至约3.3 g/L（图3）。在此历程中钻研者还发现了甘油的积攒，这些都剖析PP循环以及转氢循环导致细胞内的NADH过剩。

图3.分解能量零星发生过多NADH提供高复原度化学品分解。a. 磷酸果糖激酶下调的PP循环展现图。b. PP循环散漫转氢循环后退了琥珀酸的破费。c. PP循环散漫转氢循环后退了甘油的破费

钻研者模拟线粒体内的氧化呼吸链，表白了两种外部NADH脱氢酶NDE1以及NDE2，将胞质NADH与线粒体电子传递链分割起来，患上到菌株SynENG012（图4a-b）。不才华TCA循环关键基因异柠檬酸脱氢酶IDH2的表白水同样艰深艰深，细胞妨碍逐渐受损致使致去世；放入分解能量零星（转氢循环以及外部呼吸链）后，细胞妨碍不受影响（图4c-d）。这些剖析分解能量零星可能替换胞内原有能量零星发挥熏染，反对于细胞妨碍。

图4.分解能量零星反对于细胞妨碍。a. 双能量引擎妄想展现图。b. 双能量零星的偏激脱羧导致细胞妨碍受损。c. 无分解能量零星时，TCA循环下调导致细胞妨碍受损。d. 分解能量零星可替换TCA循环反对于细胞妨碍

运用分解能量零星增长脂质破费

做作界的产油真菌中线粒体内的异柠檬酸脱氢酶受损会导致油脂的偏激破费，因此先前的钻研中，钻研者在已经优化的产逍遥脂肪酸（Free Fatty Acids，FFAs）菌株动态调控IDH2的表白，患上到菌株Y&Z032[2]。可是摇瓶发酵后细胞妨碍以及FFAs产量都着落了。钻研者预料这是由于胞内能量提供缺少，因此放入了转氢循环以及外部呼吸链，患上到的菌株SynENG024生物量相对于后退100%，FFA产量后退200%（图5a-c）。这也进一步印证了分解能量零星可能反对于细胞妨碍以及高复原性化合物的破费。

此外，钻研者还过表白差距源头的果糖-1,6-二磷酸酶FBP1来后退NADPH提供（图5d）；运用差距的启动子微调NADPH以及ATP的比例，但并未审核到FFAs产量的清晰后退。因此在胞内表白了非氧化糖酵解（Non-oxidative glycolysis，NOG）道路，将PP道路部份分流到乙酰辅酶A的分解。如预期所料，FFAs产量后退了30%（图5e）。这剖析最优破费需要散漫多策略实现。

分批补料发酵试验中，钻研者在FFAs破费的最佳菌株SynENG050中复原了残缺功能的TCA循环来防止高浓度乙醇的积攒，又过表白一份FFAs分解道路来相助碳源以及破费过多的NADH，患上到菌株SynENG058，发酵后运用Dodecane妨碍提取，患上到20 g/L的FFAs，产率抵达0.134 g FFAs/g葡萄糖，为最高实际患上率的40%（图5f）。

图5.分解能量零星后退FFAs破费。a. 双能量引擎提供FFAs破费展现图。b. 分解能量零星可替换TCA循环反对于细胞妨碍。c. 分解能量零星可替换TCA循环反对于FFAs破费。d. 果糖-1,6-二磷酸酶过表白后退了FFAs的破费。e. NOG道路与分解能量零星相助后退了FFAs的破费。f. 限糖限氮条件下SynENG058菌株的补料分批发酵。

生物技术的挑战之一是若何在刚性代谢收集的根基上修正胞内能量（ATP）以及复原力（NADH/NADPH）的相对于化学计量比，来积攒过多能量/复原力妨碍产物分解。本文构建了一个分解能量零星为细胞提供格外的能量以及复原力，经由试验验证，该零星可替换原有的TCA循环，可反对于高复原度化学品的破费，也可与其余道路相助高效破费以乙酰辅酶A为前体的化学品。这是第一个经由理性妄想构建的分解能量零星，这项钻研揭示了细胞能量代谢收集的可塑性：尽管经由了多少百万年的进化，细胞的能量代谢收集依然可能重构。

该钻研使命取患上国家重点研发妄想（2020YFA0907800，2021YFA0911000）、国做作面上基金（NSFC 32071416）、深圳分解院交织名目（JCHZ20200003）、深圳市微生物药物智能制作重点试验室以及深圳市分解生物学立异钻研院的反对于。

参考文献：

[1] Zhang, Y. et al. Adaptive mutations in sugar metabolism restore growth on glucose in a pyruvate decarboxylase negative yeast strain. Microb Cell Fact 14, 116, doi:10.1186/s12934-015-0305-6 (2015).

[2] Yu, T. et al. Reprogra妹妹ing Yeast Metabolism from Alcoholic Fermentation to Lipogenesis. Cell 174, 1549-1558 e1514, doi:10.1016/j.cell.2018.07.013 (2018）.

（原问题：Nature Metabolism丨理性妄想构建分解能量零星双引擎助力细胞工场）